藏药马尿泡组织培养、发根培养体系的建立及Pt-H6H 基因的克隆

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	藏药马尿泡组织培养、发根培养体系的建立及Pt-H6H 基因的克隆
	雷天翔
学位类型	硕士
导师	周党卫
	2016
学位授予单位	中国科学院大学
学位授予地点	北京
关键词	马尿泡组织培养发状根托烷类生物碱莨菪碱-6β-羟化酶基因
其他摘要	马尿泡（Przewalskia tangutica Maxim.）、山莨菪（Anisodus tanguticus）和天仙子（Hyoscyamus niger L.）为生长在青藏高原及周边地区的一年生或多年生草本植物，隶属于茄科（Solanaceae）天仙子亚族（Hyoscyaminae Dunal），根和种子中含有丰富的托烷类生物碱（Tropane alkolids），具有消炎、止痛和治疗神经性疾病等作用。其中马尿泡是单种成属（Przewalskia Maxim）植物，也是青藏高原的特有高产碱濒危植物，被藏医广泛用于治疗一些地方性疾病，具有很高的药用价值。本论文以马尿泡(P.tangutica)为研究对象，山莨菪(A.tanguticus)和天仙子(H.niger)为对照材料，开展马尿泡组织培养和发根培养技术的研究，旨在解决马尿泡种质资源保存和植物体内托烷类生物碱（特别是东莨菪碱）含量变化及调控等问题，为后期深入研究基因工程发根反应器和工厂化生产托烷类生物碱奠定基础。本研究取得了如下结果： 1、本研究筛选出适合马尿泡、山莨菪和天仙子的种子萌发优化条件为 400ppm 赤霉素预处理 24 h，75%乙醇浸泡 1 min，50% NaClO（1：1 稀释原液）消毒 20 min，22℃ 暗培养，种子无菌苗的成活率均保持在 90%以上，为建立三种植物，特别是马尿泡的种质资源保存提供了依据和技术保障。 2、在相同培养条件下，比较无菌苗各组织中托烷类生物碱的含量发现，同一植物不同组织托烷类生物碱的含量不同，如马尿泡根是托烷类生物碱积累的主要部位(14.12 mg/100g)；不同植物托烷类生物碱的含量也有差异，东莨菪碱在不同植物无菌苗根中含量的大小顺序为山莨菪（12.90 mg/100g ）>天仙子（9.90mg/100g ）>马尿泡（3.12 mg/100g），表明植物的遗传背景和器官分化可能影响托烷类生物碱的合成和转运。幼嫩的无菌苗与野生植株相比，总生物碱的含量明显降低，表明发育时期和复杂的环境因素也可能调控托烷类生物碱的合成。 3、植物激素水平在细胞脱分化、再分化和马尿泡快繁体系的建立中扮演着重要的角色，本研究筛选出适合马尿泡不定芽芽增殖培养基为 MS＋6-BA（6-Benzylaminopurine） 2.0 mg/L＋NAA（1-naphthylacetic acid） 0.5 mg/L，生根培养基为 MS+NAA（1-naphthylacetic acid）0.5 mg/L，愈伤组织诱导和继代培养基为 MS+ 0.5 mg / L 6-BA（6-Benzylaminopurine） + 1.0 mg / L NAA1-naphthylacetic acid）+ 0.5 mg / L 2, 4-D（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid）。 4、植物次生代谢产物是植物为适应不良环境而产生的一类防御物质，实验发现，10℃胁迫后，显著提高了马尿泡愈伤组织中东莨菪碱的含量，但樟柳碱和阿托品的含量有所降低，表明控制托烷类生物碱合成的通路酶可能对低温的应答机制不同。15 mmol/L NaCl 胁迫提高了愈伤组织中托烷类生物碱的含量，表明适当的盐胁迫能够促进托烷类生物碱的合成。愈伤组织相对于分化程度较高的根和叶托烷类生物碱的含量较低，表明器官建成可能参与调控托烷类生物碱的合成。 5、植物发根技术被广泛用于提高托烷类生物碱的含量。本论文研究了菌种和外植体对马尿泡的发根形成的影响并成功建立了马尿泡发根培养体系，研究发现，菌种 ATCC10060 浸染马尿泡下胚轴，诱导率最高，为 33.33%。在相同条件下，培养马尿泡，山莨菪和天仙子三种植物的发状根发现，随着培养体积逐渐增大，收获的发根的鲜重和干重也随之增加，在 500 mL 培养液中，马尿泡、山莨菪和天仙子的发根鲜重分别增加了 48.45、61.69 和 41.95 倍。HPLC 法测定三种植物发根中托烷类生物碱的含量，结果表明，不同植物发根中托烷类生物碱的含量明显高于种子无菌苗根，Ri 质粒 T-DNA 整合到植物基因组中显著提高了托烷类生物碱的含量。不同植物发根的形态特征和托烷类生物碱的含量存在差异，如马尿泡发根系 RPt03 在固体培养的后期，发根周围会产生大量的愈伤组织，进一步表明植物遗传背景影响发根的形成和发根中托烷类生物碱的含量。同时，发根中积累较多的阿托品，可能由于控制托烷类生物碱合成的关键酶基因的表达量太低或者培养条件不适导致酶活性降低，从而抑制阿托品成功地向东莨菪碱的生物转化，具体机制目前尚不清楚。 6、本研究从三种植物中克隆到托烷类生物碱合成的限速酶（莨菪碱 6β-羟化酶，H6H）基因，首次从马尿泡中扩增到 H6H 基因的 cDNA 编码的全长序列，基因全长 1328 bp，编码 345 个氨基酸，序列分析结果显示，与茄科的 Anisodus acutangulus H6H 基因的相似度高，包含一个 2OGFeII-Oxy、一个 DIOX-N 结构域和两个离子结构域，但氨基酸序列分析表明，在保守结构域和其周围有个别氨基酸的突变，可能与它特殊的功能进化密切相关。
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://210.75.249.4/handle/363003/5897
专题	中国科学院西北高原生物研究所
作者单位	中国科学院西北高原生物研究所
推荐引用方式 GB/T 7714	雷天翔. 藏药马尿泡组织培养、发根培养体系的建立及Pt-H6H 基因的克隆[D]. 北京. 中国科学院大学,2016.

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